Спектрофотометрический метод анализа исследует



Спектрофотометрия. Сущность метода, используемые приборы, достоинства и недостатки, применение.

Физико-химические илиинструментальные методы анализа основаны на измерении с помощью приборов (инструментов) физических параметров анализируемой системы, которые возникают или изменяются в ходе выпол­нения аналитической реакции и функционально связаны с ее качественным и количественным составом.

Классификация

· Оптические методы, основанные на исследовании оптических свойств анализируемых систем:

· Электрохимические методы, основанные на исследовании электрохимических свойств анализируемых систем:

· .Методы анализа, основанные на исследовании других свойств анализируемых систем:

Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР)

Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

Анализ по теплопроводности.

Достоинства

· Низкий предел обнаружения (1-10-9 мкг) и малая предельная концентрация (до

10-12) определяемого вещества.

· Высокая селективность метода (возможность определять составные компоненты непосредственно в смесях, без их разделения).

· Экспрессность (быстрота) проведения анализа, возможность автоматизации и компьютеризации.

Недостатки

· Иногда воспроизводимость результатов бывает хуже, чем в классических химических методах – гравиметрии и титриметрии.

· Высокие погрешности (ошибки) — ±5%, а в некоторых случаях – до ±20% по сравнению с классическими методами, где они не превышают ±(0,1-0,5%).

· Сложность применяемой аппаратуры, ее высокая стоимость.

· Необходимость применения эталонов.

Оптические методы анализа. Классификация оптических методов анализа (по изучаемым объектам, по характеру взаимодействия электромагнитного излучения с веществом, по используемой области электромагнитного спектра, по природе энергетических переходов).

К оптическим методам анализа относят физико-химические методы, основанные на взаимодействии электромагнитного излучения с веществом.

1) по изучаемым объектам – атомный и молекулярный спектральный анализ;

2) по характеру взаимодействия электромагнитного излучения с веществом на:

б) эмиссионный спектральный,

в) пламенная фотометрия,

г) молекулярный абсорбционный,

е) спектральный анализ с эффектом комбинационного рассеяния света,

3) по области используемого электромагнитного спектра: а) спектроскопия в УФ области в интервале длин волн 200-400 нм и в видимой области в интервале длин волн 400-760 нм,

б) ИК- спектроскопия, изучающая участок электромагнитного спектра в интервале 0,76-1000 мкм (1 мкм=10-6м).

4) по природе энергетических переходов различают следующие спектры:

а) электронные (в УВИ-области) – возникают при изменении энергии электронных состояний частиц (атомов, ионов, радикалов, молекул),

б) колебательные спектры — спектры ИК области и спектры комбинационного рассеяния света, которые возникают при изменении энергии колебательных состояний частиц (двух- и многоатомных ионов, радикалов, молекул, а также жидких и твердых фаз),

в) вращательные спектры охватывают дальнюю ИК и микроволновую область электромагнитного излучения, возникают при изменении энергии вращательных состояний молекул, двух- и многоатомных ионов, радикалов.

!84Молекулярный спектральный анализ в ультрафиолетовой и видимой области спектра Сущность метода. Основные законы светопоглощения. Оптическая плотность (А) и светопропускание (Т), связь между ними. Коэффициент поглощения света (k) и коэффициент погашения — молярный (Е) и удельный.

Основной закон светопоглощения – закон Бугера (1729), Ламберта (1760) и Бера (1852).

· Первый закон (Бугера-Ламберта) фотометрии гласит: доля светового потока, поглощенного однородной средой, прямо пропорциональна толщине поглощающего слоя

ΔI – поглощенная часть падающего светового потока I,

k1 – коэффициент пропорциональности,

l – толщина поглощающего слоя.

· Второй закон (Бугера-Бера) гласит:

доля светового потока, поглощенного данным тонким слоем внутри однородной среды, пропорциональна числу светопоглощающих частиц в единице объема, т.е. концентрации

k2 — коэффициент пропорциональности,

85Сущность методов абсорбционного анализа. Колориметрия и фотоэлектроколориметрия, их применение (метод стандартных серий, метод уравнивания окрасок, метод разбавления).

Фотометрический анализ включает следующие методы абсорбционного анализа: колориметрию, фотоэлектроколориметрию, спектрофотометрию.

• Интенсивность окраски растворов можно измерять различными методами. Среди них выделяют субъективные (визуальные) методы колориметрии и объективные, то есть фотоколориметрические.

• Визуальными называют такие методы, при которых оценку интенсивности окраски испытуемого раствора делают невооруженным глазом.

• При объективных методах колориметрического определения для измерения интенсивности окраски испытуемого раствора вместо непосредственного наблюдения пользуются фотоэлементами. Определение в этом случае проводят в специальных приборах — фотоколориметрах, поэтому метод получил название фотоколориметрического.

К визуальным методам относятся:

— метод стандартных серий;

— метод колориметрического титрования, или дублирования;

Метод стандартных серий. При выполнении анализа методом стандартных серий интенсивность окраски анализируемого окрашенного раствора сравнивают с окрасками серии специально приготовленных стандартных растворов (при одинаковой толщине слоя).

Метод колориметрического титрования (дублирования) основан на сравнении окраски анализируемого раствора с окраской другого раствора — контрольного.

Метод уравнивания отличается от описанных выше визуальных колориметрических методов, в которых подобие окрасок стандартного и испытуемого растворов достигается изменением их концентрации.

Фотоэлектроколориметрия применяется для измерения поглощения света или пропускания окрашенными растворами. Приборы, используемые для этой цели, называются фотоэлектроколориметрами (ФЭК).

Фотоэлектрические методы измерения интенсивности окраски связаны с использованием фотоэлементов. В отличие от приборов, в которых сравнение окрасок производится визуально, в фотоэлектроколориметрах приемником световой энергии является прибор — фотоэлемент.

Спектрофотометрия. Сущность метода, используемые приборы, достоинства и недостатки, применение.

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ.Это метод фотометрического анализа, в котором определение содержания вещества производят по поглощению им монохроматического света в види­мой, УФ- и ИК-областях спектра. В спектрофотометрии, в отличие от фото­метрии, монохроматизация обеспечивается не светофильтрами, а монохроматорами, позволяющими непрерывно изменять длину волны. В качестве монохроматоров используют призмы или дифракционные решетки, которые обеспечивают значительно более высокую монохроматичность света, чем светофильтры, поэтому точность спектрофотометрических определений выше.

Спектрофотометрические методы, по сравнению с фотоколориметрическими, позволяют решать более широкий круг задач:

— проводить количественное определение веществ в широком интервал длин волн (185-1100 нм);

— осуществлять количественный анализ многокомпонентных систем (одновременное определение нескольких веществ);

— определять состав и константы устойчивости светопоглощающих комплексных соединений;

— определять фотометрические характеристики светопоглощающих соединений.

Фотометрическим методом можно определять также компоненты смеси двух и более веществ.

!87Количественный фотометрический анализ. Условия фотометрического определения. Определение концентрации анализируемого раствора: метод градуировочного графика, метод одного стандарта, определение концентрации по молярному (или удельному) коэффициенту погашения, метод добавок стандарта.

Фотометрический метод анализа – это анализ, основанный на поглощении света молекулами анализируемого вещества и сложными ионами в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной областях спектра.

Для проведения фотометрического анализа определяемый элемент переводят в окрашенное соединение, поглощающее свет. Через раствор с этим соединением пропускают световой поток интенсивностью Iокоторый, при прохождении через поглощающий раствор, разлагается на составляющие

Для определения концентрации анализируемого вещества используют следующие методы:

· молярного коэффициента светопоглощения;

· сравнения оптических плотностей стандартного и исследуемого окрашенных растворов;

Метод градуировочного графика. Для определения концентрации вещества этим методом готовят серию из 5-8 стандартных растворов различной концентрации. При выборе интервала концентраций стандартных растворов руководствуются следующими положениями:

— он должен охватывать область возможных измерений концентрации исследуемого раствора;

— оптическая плотность исследуемого раствора должна соответствовать примерно середине градуировочной кривой;

— желательно, чтобы в этом интервале концентраций соблюдался основной закон светопоглощения, то есть график зависимости был прямолинейным;

— величина оптической плотности должна находиться в пределах 0, 14- 1,3.

Измеряют оптическую плотность стандартных растворов и строят график зависимости А(С). Определив Ах исследуемого раствора, по градуировочному графику находят Сх

Метод добавок — это разновидность метода сравнения, основанный на сравнении оптической плотности исследуемого раствора и того же раствора с добавкой известного количества определяемого вещества.

Применяют его для устранения мешающего влияния посторонних примесей, определения малых количеств анализируемого вещества в присутствии больших количеств посторонних веществ. Метод требует обязательного соблюдения основного закона свето-поглощения.

Этот метод применяют при анализе растворов сложного состава, так как он позволяет автоматически учесть влияние «третьих» компонентов.

!88Дифференциальный фотометрический анализ. Сущность метода, способы определения концентраций (расчетный метод, метод градуировочного графика). Погрешностu спектрофотометрuческого анализа, и их природа, устранение.

Дифференциальная спектрофотометрия – это метод измерения светопоглощения анализируемого раствора по отношению к среде сравнения, оптическая плотность А которой больше нуля.

Метод используется тогда, когда концентрация раствора большая (десятки %) и оптическая плотность высока.

Основным достоинством метода является уменьшение ошибки фотометрических определений.

СущностьметодаГотовят серию (5-10) эталонных растворов определяемого в-ва с различной , точно заданной концентрацией С0, С1, С2 … Сn . Вначале при выбранной λ в оба канала спектрофотометра помещают одинаковые кюветы с одним и тем же эталонным раствором (С определяемого в-ва = С0), относительно которого будут проводить последующие измерения, и устанавливают шкалу оптической плотности в положении А=0. Затем при той же λ измеряют Аi (i=1.2.3. …n) каждого эталонного раствора с С0 и с А0 (относительно чистого растворителя), после чего находят Сх определяемого в-ва следующими способами:

Читайте также:  Для чего делают расширенный анализ крови

Расчетный способ.Согласно закону светопоглощения:

Если ввести фактор пересчета F = то:

F находят по результатам измерений Аi эталонных растворов относительно эталонного раствора с С0

n – число измеренных эталонных растворов

Способ градуировочного графика. Для построения градуировочного графика в дифференциально-фотометрическом методе готовят несколько стандартных растворов с концентрациями определяемого вещества меньшими, чем в растворе сравнения, и столько же стандартных растворов с концентрациями большими, чем в растворе сравнения. При измерении оптических плотностей стандартных растворов, концентрация определяемого вещества в которых больше, чем в растворе сравнения (Сср < С), полученные значения относительной оптической плотности берут со знаком плюс. Для растворов с концентрацией определяемого вещества меньшей, чем в растворе сравнения (Сср > С), полученные значения относительной оптической плотности берут со знаком минус. В последнем случае применяют обратный порядок измерений: анализируемые растворы условно принимают за растворы сравнения, их оптическая плотность А = 0, и по отношению к ним измеряют оптическую плотность раствора сравнения.По полученным данным строят градуировочный график
Затем измеряют относительную оптическую плотность исследуемого раствора, а неизвестную концентрацию определяемого вещества Сх в этом растворе находят по градуировочному графику.

Источник

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ — область измерительной техники, разрабатывающая методы и приборы для определения спектральных характеристик объектов. В медико-биологических исследованиях наибольшее значение имеет анализ молекулярных и атомных спектров поглощения (см. Спектральный анализ, Спектроскопия). С помощью Спектрофотометрии определяют в различных биол. пробах содержание ферментов, гормонов, белков, витаминов, многих неорганических веществ, анализируют качественный и количественный состав мазков крови и т. д.

В основе Спектрофотометрии лежит регистрация степени ослабления монохроматического пучка света при его прохождении через вещество (закон Бугера— Ламберта — Беера: lg(I/I) = E*c*d, где I и I — интенсивность света соответственно до и после его прохождения через слой вещества; с — концентрация вещества, поглощающего свет; d — толщина слоя; Е — коэффициент, зависящий от длины волны падающего света и природы вещества). Отношение интенсивности прошедшего света и интенсивности падающего (Т = 1/10) называют пропусканием. Обычно эту величину выражают в процентах от интенсивности падающего света. На практике часто используется также величина логарифма пропускания, взятая с обратным знаком (D = -lgT = E*c*d) — так наз. оптическая плотность, величина к-рой линейно связана с концентрацией вещества. Если величина с выражена в молях на литр, d — в сантиметрах, то Е называют молярным коэффициентом поглощения или молярным коэффициентом экстинкции. Он характеризует вероятность поглощения веществом электромагнитной энергии и численно равен оптической плотности раствора (D) толщиной 1 см и с концентрацией вещества, равной 1 моль на 1 л.

Закон Бугера — Ламберта — Беера справедлив лишь для плоскопараллельного пучка монохроматического света и при выполнении ряда условий. На практике часто приходится сталкиваться с отклонениями от этого закона. К числу причин отклонения могут быть отнесены физ.-хим. свойства анализируемого вещества или всего раствора (диссоциация, флюоресценция и др.)» инструментальные факторы (напр., отсутствие должной степени монохроматичности пучка света), факторы, обусловленные неоднородностью изучаемого объекта в пучке света (особенно отчетливо проявляется при микроспектрофотометрии объектов) и т. д.

Важным принципом С. является принцип аддитивности (т. е. суммации) оптических плотностей, в соответствии с к-рым величина оптической плотности смеси соединений, подчиняющихся закону Бугера — Ламберта — Беера и не вступающих в хим. взаимодействие друг с другом, равна сумме оптических плотностей этих соединений.

Количественный анализ пробы, содержащей одно вещество, включает следующие операции: 1) регистрацию полного спектра поглощения вещества (D измеряют как функцию длины волны λ), выбор аналитической длины волны (λанал); 2) приготовление 6—7 эталонных (стандартных) р-ров, охватывающих весь ожидаемый диапазон концентраций определяемого вещества в анализируемых р-рах, и измерение оптической плотности (Dст) этих растворов при λанал. Затем строят график зависимости величины оптической плотности Dст от концентрации эталонного р-ра. Наиболее точные результаты дают измерения в диапазоне D в пределах 0,05—1,50. В случае, если построенная зависимость, т. е. D = f(cст), линейна (определяемое вещество подчиняется закону Бугера — Ламберта — Беера), определение концентрации вещества осуществляют аналитически, используя формулу с = сст*(D/Dст). При несоблюдении закона Бугера — Ламберта — Беера количественный анализ проводят графическим методом (с помощью калибровочного графика). Оптическая плотность анализируемого р-ра во всех случаях измеряется относительно р-ра сравнения (прямой спектрофотометрический метод). В качестве р-ра сравнения может быть использован как чистый растворитель, так и р-р, содержащий все компоненты анализируемого р-ра за исключением определяемого вещества. В ряде случаев в качестве р-ра сравнения целесообразнее использовать р-р определяемого вещества известной концентрации (обычно более низкой, чем в анализируемых пробах). При проведении такого рода измерений говорят о дифференциальной С.

Нередко проводят регистрацию производных спектров поглощения. Производную С. применяют в основном в качественном анализе с целью выявления сильно перекрывающихся спектральных линий, при определении точного положения максимума размытых полос поглощения, идентификации малопоглощаю-щих примесей, установлении структуры органических соединений и т. д.

С. проводится в инфракрасной (ПК), УФ и видимой областях спектра. К приборам, работающим в видимой области, относятся также спектрофотометры комбинационного рассеяния (КР-спектрофотометры). С помощью С. комбинационного рассеяния изучают колебательные энергетические уровни молекул (см. Спектральный анализ, Молекула), к-рые могут быть использованы для определения числа S — S-связей в белках, числа спаренных и неспаренных оснований в нуклеиновых к-тах, относительного содержания альфа- и бета-спирализованных участков в полипептидах и др.

С. микрообъектов, или микроспектрофотометрия, — относительно самостоятельная область исследования (см. Микроспектральный анализ). Микроспектрофотометры, как и микроспектрофлюориметры, обычно предназначены для работы в видимой области спектра, реже в УФ-области и выполняются по одно лучевой схеме. Для регистрации распределения поглощающего вещества по площади микрообъекта используют различного рода сканирующие устройства: систему оптических зондов, перемещающиеся по заданной программе предметные столики, телевизионную (электронную) развертку изображения и проч. Приборы совр. конструкций снабжаются микрокомпьютерами, автоматически обрабатывающими получаемую информацию и позволяющими анализировать форму микрообъектов (напр., при автоматическом анализе мазков крови), и др. В проточных микрофлюориметрах проводится скоростной анализ флюоресцентных характеристик индивидуальных клеток крови, окрашенных соответствующими красителями. Наметилась тенденция к разработке узкоспециализированных микроспектрофотометров и микроспектрофлюориметров, предназначенных для работы в условиях клин, лабораторий.

Атомарные спектры поглощения изучают с помощью пламенных спектрофотометров (см. Фотометрия). Атомно-абсорбционные методы дают возможность определения практически всех элементов периодической системы и отличаются высокой избирательностью и чувствительностью (до 10 -14 г).

Приборы для спектрального анализа комплектуются электронными устройствами обработки и управления, блоками автоматической подачи проб, самописцами, блоками цифро-печати, устройствами автоматической развертки спектра, позволяют определять в одной пробе несколько элементов.

С. широко применяется в биол. исследованиях. Она используется для количественного определения самых разнообразных биол. соединений: ферментов, витаминов, гормонов, белков и других азотистых веществ, нуклеиновых к-т, углеводов, спиртов, альдегидов, фенолов, кетонов, органических к-т, липидов, пигментов, ряда неорганических веществ (напр., натрия, калия, кальция, железа, цинка, хлора, серы) и др.

Приборы

Основными узлами спектрофотометров обычно являются: источник излучения; монохроматор, предназначенный для выделения из спектра излучения источника узких спектральных интервалов; приемник излучения; отсчетное устройство. Спектрофотометры подразделяются на однолучевые и двухлучевые, нерегистрирующие и регистрирующие. Распространенные в мед. лабораториях однолучевые нерегистрирующие спектрофотометры представляют собой достаточно простые и дешевые приборы с оптикой из оптического стекла или кварца. Использование кварцевой оптики дает возможность проводить измерения в области 200—1100 нм, охватывающей ультрафиолетовый, видимый и ближний инфракрасный участки спектра. Исследуемый образец и эталон последовательно вводят в световой пучок. Результаты сравнения пучков в величинах пропускания (в %) или оптической плотности (D) указываются на стрелочном или цифровом приборе.

Оптическая схема спектрофотометров чаще всего автоколлимационная. Источником света обычно служит водородная лампа (для работы в области спектра 220—320 нм) или лампа накаливания (для работы в области спектра 320—1100 нм). Луч света через систему зеркал попадает на диспергирующую призму, к-рая разлагает его, образуя спектр. Вращая призму, можно получать на выходе монохроматора свет волн различной длины; затем лучи проходят эталон (образец) и попадают на регистратор — светочувствительный слой фотоэлемента. Оценка производится либо с помощью калибровочного графика, либо на основе построения функциональной зависимости между величинами оптической плотности и длины волны.

Читайте также:  Что можно узнать по молекуле ДНК

К однолучевым нерегистрирующим спектрофотометрам относятся спектрофотометры СФ-4, СФ-4А, СФД-2, СФ-16, СФ-26. В частности, спектрофотометр СФ-26 имеет расширенный в ультрафиолетовой области (до 186 нм) спектральный диапазон, высокое разрешение в ультрафиолетовой области спектра и обеспечивает по сравнению с аналогами лучшую сходимость результатов измерения коэффициентов пропускания. Диапазон измерения коэффициента пропускания от 0 до 100%. Основная погрешность градуировки шкалы волн в ультрафиолетовой области 0,1 нм, в видимой области 0,5 нм, в ближней инфракрасной области 5,0 нм.

В двухлучевых регистрирующих спектрофотометрах поток от источника излучения разделяется на два пучка: основной и пучок сравнения (эталонный). В основной пучок устанавливается исследуемый образец, в пучок сравнения — эталон. При измерениях коэффициента пропускания веществ в растворе обычно используют две идентичные кюветы, одна из к-рых заполняется исследуемым образцом, а другая эталоном.

Принципиальная схема автоматического регистрирующего спектрофотометра: 1 — источник света с отражателем; 2 — диски-модуляторы; 3 — исследуемая проба; 4 — линейный оптический клин; 5 — система зеркал; 6 — приемник излучения со сканирующим монохроматором; 7 — преобразователь светового потока в электрический сигнал; 8 — усилитель электрического сигнала; 9 — сервомотор, управляющий перемещениями линейного оптического клина; 10 —аналоговый или цифровой регистратор.

Принцип действия двух лучевых приборов (рис. ) основан на нулевом методе. Приемник излучения освещается поочередно промодулированным (с помощью зеркальных секторных дисков — модуляторов) пучком света, прошедшим через исследуемый образец (или отраженный от него), и пучком сравнения. Если световые потоки в основном и эталонном каналах равны, то освещенность приемника излучения будет постоянна в любой момент времени и сигнала переменного тока на входе усилительной системы не будет. При поглощении образцом части светового потока суммарный световой поток на приемнике (стоит на выходе сканирующего монохроматора) будет изменяться с частотой модуляции, на входе усилителя появится сигнал такой же частоты. Напряжение сигнала усиливается и подается на сервомотор, приводящий в движение устройство, ослабляющее пучок сравнения, работающее до тех пор, пока не исчезнет разность световых потоков, т. е. пока не исчезнет сигнал на входе усилителя. Ослабление пучка сравнения осуществляется поворотом находящейся в пучке поляризационной призмы или введением в него компенсирующего оптического клина. Одновременно с движением компенсирующего устройства перемещается перо самописца по бланку. Автоматический поворот диспергирующего устройства (чаще всего призмы) позволяет непрерывно регистрировать эти величины.

К регистрирующим спектрофотометрам относятся приборы видимого диапазона спектра СФ-8, СФ-10, СФ-14, СФ-18 и инфракрасные спектрофотометры одно лучевые ИКС-12, ИКС-21, а также двухлучевые ИКС-14, ИКС-22, ИКС-29, ИКС-31. Инфракрасные спектрофотометры со сменными призмами позволяют измерять коэффициент пропускания веществ в области спектра 1 — 25 мкм и дальше. Они обеспечивают автоматическую запись спектра с высокой точностью и разрешающей силой. Однако при исследовании мед.-биол. объектов инфракрасные спектрофотометры применяются ограниченно из-за сильного поглощения ИК-излучения водой, являющейся основным компонентом живой ткани.

Источник

Как провести спектрофотометрический анализ?

Спектрофотометрический анализ широко применяется для измерения концентрации растворенных веществ, для чего учитывается количество светового излучения, которое поглощает раствор. Метод отличается высокой эффективностью, так как позволяет получить информацию о количестве различных соединений в смеси и их концентрации. Проведение анализа требует не только наличия качественного оборудования, такого как фотометры, но и соблюдения определенного алгоритма действий.

Подготовка и основные измерения

В первую очередь производится включение устройств, которые разогреваются в течение 15 минут. Все кюветы и пробирки должны быть предварительно вымыты, так как от их чистоты зависит достоверность эксперимента. В емкости заливается необходимое количество раствора, после чего осуществляется приготовление контрольной смеси. Перед помещением кюветы внутрь спектрофотометра ее следует тщательно протереть тряпочкой без ворса.

Основной этап спектрофотометрического анализа предполагает выбор определенной длины волны света для проведения исследования. Данный параметр задается с помощью панели управления оборудованием. Кроме того, прибор должен пройти калибровку, для чего используются холостые растворы. На данной стадии важно убедиться в том, что устройство было правильно настроено, допускается проведение повторной калибровки. После этого в оборудование помещаются образцы, производится регистрация значения коэффициента оптической плотности или пропускания. Исследуемые вещества могут включать в себя несколько примесей, обнаружение соединений осуществляется с помощью повторения эксперимента для всего спектра с шагом 25 нанометров.

Обработка данных

Анализ полученной информации заключается в расчёте коэффициента пропускания и вычислении оптической плотности образца. Первый показатель отражает объем света, который прошел через исследуемую смесь и достиг спектрофотометра. Вторая характеристика демонстрирует количество волн, поглощенных компонентами, растворенными в жидкости. Для визуализации результатов осуществляется построение координатной плоскости, которая будет отражать, как оптическая плотность зависит от длины волны. Следует учитывать, что перед использованием спектрофотометров В-1200 и других моделей, необходимо внимательно ознакомиться с инструкцией и рекомендациями по использованию.

Источник

Спектрофотометрия в УФ и видимой областях (ОФС.1.2.1.1.0003.15)

Спектроскопические методы анализа основаны на избирательном поглощении электромагнитного излучения анализируемым веществом и служат для исследования строения, идентификации и количественного определения светопоглощающих соединений.

В зависимости or используемой аппаратуры в фармацевтическом анализе различают следующие методы анализа, основанные на поглощении электромагнитного излучения и испускании света:

  • спектрофотометрия в ультрафиолетовой (УФ) и видимой областях;
  • спектрометрия в инфракрасной (ИК) области;
  • атомно-эмиссионная спектрометрия (АЭС);
  • атомно-абсорбционная спектроскопия (ААС);
  • флуоримегрия;
  • спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР);
  • масс-спектрометрия;
  • рамановская спектрометрия;
  • рентгеновская флуоресцентная спектрометрия;
  • рентгеновская порошковая дифрактометрия.

Ряд длин волн, для которых проводятся измерения методами абсорбционной спектрофотометрии, охватывает спектральную область от коротких длин волн в УФ-области до ИК-области. Для удобства отнесений этот спектральный ряд делится на следующие диапазоны длин волн: УФ (от 190 до 380 нм), видимый (от 380 до 780 нм), ИК (от 0,78 до 400 мкм).

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ В УЛЬТРАФИОЛЕТОВОЙ И ВИДИМОЙ ОБЛАСТЯХ

Уменьшение интенсивности монохроматического излучения, проходящего через гомогенную поглощающую среду, количественно описывается законом Бугера-Ламберта-Бера:

Т – пропускание, отношение интенсивности светового потока, прошедшего через вещество, к интенсивности падающего на вещество светового потока: Т = I/I;
I – интенсивность прошедшего монохроматического излучения;
I – интенсивность падающего монохроматического излучения;
ε – молярный показатель поглощения;
с – молярная концентрация вещества в растворе;
b – длина оптического пути или толщина слоя, в сантиметрах.

Величина log10(1/Т) носит название оптической плотности, обозначается буквой А и является измеряемой величиной. В отсутствии других физико-химических факторов измеренная оптическая плотность (А) пропорциональна концентрации вещества в растворе (с) и толщине слоя (b).

Величина представляет собой удельный показатель поглощения, т.е. оптическую плотность раствора вещества с концентрацией 10 г/л (1 г/100 мл) в кювете с толщиной слоя 1 см. Величиныи ε связаны соотношением:

М.м. – молекулярная масса исследуемого вещества.

Измерение оптической плотности

Если нет других указаний в фармакопейной статье, измерение оптической плотности проводят при указанной длине волны с использованием кювет с толщиной слоя 1 см и при температуре (20 ± 1) °С по сравнению с тем же растворителем или той же смесью растворителей, в которой растворено вещество. При измерении оптической плотности раствора при данной длине волны оптическая плотность кюветы с растворителем, измеренная против воздуха при той же длине волны, не должна превышать 0,9 и, желательно, чтобы она была не менее 0,2.

Спектр поглощения представляют таким образом, чтобы оптическая плотность или ее некоторая функция были приведены по оси ординат, а длина волны или некоторая функция длины волны – по оси абсцисс.

Если в фармакопейной статье для максимума поглощения указывается только одна длина волны, то это означает, что полученное значение максимума не должно отличаться от указанного более чем на ± 2 нм.

Приборы

Спектрофотометры, предназначенные для измерений в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, состоят из оптической системы, выделяющей монохроматическое излучение в области от 190 до 800 нм и обеспечивающей его прохождение через образец, и устройства для измерения оптической плотности.

Основными частями этих приборов являются: источник излучения, диспергирующий прибор (призма или решетка), щель для выделения полосы длин волн, кюветы для образцов, детектор излучаемой энергии, встроенные усилители и измерительные приборы.

Проверка шкалы длин волн в ультрафиолетовой и видимой области. Точность калибровки прибора по шкале длин волн в спектральном ряду проверяют по приведенным в табл. 1 спектральным линиям водородной (Hβ) или дейтериевой (Dβ) разрядной лампы, линиям паров ртути (Hg) кварцево-ртутной дуговой лампы, а также по максимумам поглощения раствора гольмия перхлората (Ho) (готовый реактив для калибровки спектрофотометра представляет собой 4 % раствор гольмия оксида в 14,1% растворе хлорной кислоты). Допустимое отклонение составляет ± 1 нм для ультрафиолетовой и ± 3 нм для видимой области.

Читайте также:  Методы финансового анализа при аудите

Таблица 1. Максимумы поглощения для проверки шкалы длин волн

241,15 нм (Но) 404,66 нм (Hg)
253,7 нм (Hg) 435,83 нм (Hg)
287,15 нм (Но) 486,0 нм (Dв)
302,25 нм (Hg) 486,1 нм (Нв)
313,16 нм (Hg) 536,3 нм (Но)
334,15 нм (Hg) 546,07 нм (Hg)
361,5 нм (Но) 576,96 нм (Hg)
З65,48 нм (Hg) 579,07 нм (Hg)

Шкала длин волн может быть калибрована также при помощи подходящих стеклянных фильтров, которые имеют фиксированные полосы поглощения в видимой и ультрафиолетовой областях, а также стандартных стекол, содержащих дидим (смесь празеодима и неодима), и стекол, содержащих гольмий.

Проверка шкалы оптической плотности. Для проверки шкалы оптической плотности используют стандартные неорганические стеклянные фильтры или раствор калия дихромата при длинах волн, указанных в табл. 2, где для каждой длины волны приведено точное значение удельного показателя поглощения и допустимые пределы.

Раствор калия дихромата для проверки шкалы оптической плотности при 235, 257, 313 и 350 нм готовят следующим образом: от 57,0 до 63,0 мг (точная навеска) калия дихромата, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 130 °С, растворяют в 0,005 М растворе серной кислоты и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000 мл. Для проверки оптической плотности при 430 нм, растворяют 57,0-63,0 мг (точная навеска) калия дихромата в 0,005 М растворе серной кислоты и доводят объём раствора тем же растворителем до метки.

Таблица 2. Удельный показатель поглощения стандартов при различных длинах волн

Предельный уровень рассеянного света. Рассеянный свет может быть обнаружен при данной длине волны с использованием соответствующих фильтров или растворов: например, оптическая плотность раствора 12 г/л калия хлорида в кювете с толщиной слоя 1 см резко увеличивается между 220 и 200 нм и должна быть больше 2 при 198 нм при использовании воды в качестве раствора сравнения.

Разрешающая способность (для качественного анализа). Если есть указание в фармакопейной статье, определяют разрешающую способность спектрофотометра следующим образом. Записывают спектр 0,02 % (об/об) раствора толуола в гексане. Минимально допустимое значение отношения оптической плотности в максимуме поглощения при 269 нм к оптической плотности в минимуме поглощения при 266 нм указывают в фармакопейной статье.

Ширина спектральной щели (для количественного анализа). В случае использования спектрофотометра с изменяемой шириной спектральной щели при выбранной длине волны возможны погрешности, связанные с шириной этой щели. Для их исключения ширина щели должна быть малой по сравнению с полушириной полосы поглощения (шириной на половине оптической плотности) и в то же время должна быть максимально велика для получения высокого значения интенсивности падающего монохроматического излучения (I). Таким образом, ширина щели должна быть такой, чтобы дальнейшее ее уменьшение не изменяло величину измеряемой оптической плотности.

Кюветы. Допустимые отклонения в толщине слоя используемых кювет должны быть не более ±0,005 см. Кюветы, предназначенные для испытуемого раствора и раствора сравнения, должны иметь одинаковое пропускание (или оптическую плотность) при заполнении одним и тем же растворителем. В противном случае это различие следует учитывать.

Требования к растворителям. Для определений, производимых в ультрафиолетовой и видимой областях, образец анализируемого вещества растворяют в соответствующем растворителе, который должен быть оптически прозрачным в используемой области длин волн. Для этих областей длин волн пригодны многие растворители, в том числе вода, спирты, хлороформ, низшие углеводороды, эфиры и разбавленные растворы сильных кислот и щелочей.

Идентификация

Абсорбционную спектрофотометрию в ультрафиолетовой и видимой областях спектра применяют для определения подлинности лекарственных средств путем:

  • сравнения спектров поглощения испытуемого раствора и раствора стандартного образца; в указанной области спектра должно наблюдаться совпадение положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба;
  • указания положений максимумов, минимумов, плеч и точек перегиба спектра поглощения испытуемого раствора; расхождение между наблюдаемыми и указанными длинами волн в максимумах и минимумах поглощения не должно обычно превышать ± 2 нм.

Возможны и другие варианты применения, оговоренные в фармакопейных статьях.

Количественное определение

Определение концентрации веществ спектрофотометрическим методом основано на использовании закона Бугера-Ламберта-Бера:

В ряде случаев, даже при использовании монохроматического излучения могут наблюдаться отклонения от закона Бугера-Ламберта-Бера, обусловленные процессами диссоциации, ассоциации и комплексообразования. Поэтому предварительно следует проверить линейность зависимости оптической плотности раствора от концентрации в аналитической области. При наличии отклонений от линейной зависимости следует пользоваться не формулой (3), а экспериментально найденной зависимостью.

Обычно определение концентрации спектрофотометрическим методом проводят с использованием стандартного образца. Расчет концентрации основан на использовании уравнения:

где:

С и С – концентрации испытуемого раствора и раствора стандартного образца, соответственно;

А и А – оптические плотности испытуемого раствора и раствора стандартного образца, соответственно.

Концентрации испытуемого и стандартного раствора должны быть близки.

Вначале измеряют оптическую плотность раствора стандартного образца, приготовленного, как указано в фармакопейной статье, затем проводят измерение оптической плотности испытуемого раствора. Второе измерение проводят сразу после первого, с использованием той же кюветы, в тех же экспериментальных условиях.

Метод с использованием стандартного образца является более точным и надежным. Возможность применения значения удельного показателя поглощения в каждом конкретном случае следует обосновывать. Обычно метод с использованием значения удельного показателя поглощения применим при допусках содержания анализируемого вещества не менее ±10 % от номинального содержания.

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ

Многокомпонентный спектрофотометрический анализ (анализ смесей) применяют для одновременного количественного определения нескольких компонентов лекарственных средств, каждое из которых подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера.

Количественное определение в многокомпонентном спектрофотометрическом анализе основывается обычно на использовании уравнения:

где:

Аi – оптическая плотность испытуемого раствора при i-ой длине волны;

Еij – показатели поглощения (зависящие от способа выражения концентрации) j-го компонента образца при i-ой аналитической длине волны;

cj – концентрация j-го компонента образца.

Соответствующие методики проведения анализа и расчетные формулы указываются в фармакопейных статьях.

Производная спектрофотометрия

В производной спектрофотометрии исходные спектры поглощения (нулевого порядка) преобразуются в спектры производных первого, второго и более высокого порядков.

Спектр первой производной представляет собой график зависимости градиента кривой поглощения (скорость изменения оптической плотности от длины волны, dA/dλ) от длины волны.

Спектр второй производной представляет собой график зависимости кривизны спектра поглощения (d 2 A/dλ 2 ) от длины волны. Вторая производная при любой длине волны связана с концентрацией следующим соотношением:

Производная спектрофотометрия может быть использована как для целей идентификации веществ, так и для их количественного определения в многокомпонентных смесях, а также в тех случаях, когда имеется фоновое поглощение, вызванное присутствием веществ, содержание которых не регламентируется.

Приборы

Используют спектрофотометры, отвечающие указанным выше требованиям и оснащенные аналоговым резистивно-емкостным дифференцирующим модулем или цифровым дифференциатором, или другими средствами получения производных спектров, в соответствии с инструкцией к прибору. Некоторые методы получения спектров второй производной приводят к смещению длин волн относительно исходного спектра, что следует учитывать там, где это необходимо.

Разрешающая способность

Если указано в фармакопейных статьях, записывают спектр второй производной для раствора 0,2 г/л толуола в метаноле, используя метанол в качестве раствора сравнения. На спектре должен присутствовать небольшой отрицательный экстремум, расположенный между двумя большими отрицательными экстремумами при 261 нм и 268 нм, в соответствии с рис. 1. Если нет других указаний в фармакопейных статьях, отношение А/B должно быть не менее 0,2.

Методика

Процедура анализа аналогична применяемой в обычной спектрофотометрии, но вместо оптических плотностей используют производные. Готовят раствор испытуемого образца, настраивают прибор в соответствии с инструкцией производителя и рассчитывают количество определяемого вещества, как указано в фармакопейной статье.

Спектр второй производной раствора толуола (0,2 г/л) в метаноле

Рисунок 1. Спектр второй производной раствора толуола (0,2 г/л) в метаноле

Источник

Adblock
detector